Jensen Ackles 1978 március 1-jén Dallas-ban (Texas, USA) született a színész Roger Alan Ackles és Donna Joan Shaffer második gyermekeként. Két testvére van: egy bátyja, Joshua és egy húga, Mackenzie.

Jensen édesapja ismert színész volt a városban, ezért Jensen gyermekkorának is része volt a színészkedés, annak ellenére, hogy a gimnáziumig nem is igazán akart színészi pályára lépni. Négyévesen kezdett modellkedni, majd később abbahagyta, de 10 évesen újrakezdtete.

Az L. V. Berkner High School-ba jelentkezett, ahol sportorvosnak tanult. Ekkor felkereste két férfi: Jensen későbbi menedzsere, Craig Wargo, és egy másik ügynök Michael Einfeld. Arra kérték, hogy menjen Los Angeles-be velük, de Jensen előbb be akarta fejezni a gimnáziumot, mert azt hitte, hogy ezt a két fickót hamarosan nem is fogja érdekelni. Nem ez történt. A két férfi tartotta vele a kapcsolatot, egészen addig amíg leérettségizett, majd LA-be vitték. Arra számított, hogy legalább egy fél évig kell majd várnia az első szerepére, de szerencsére megint tévedett: rövid időn belül megkapta Malcolm szerepét az NBC Mr Rhodes c. sorozatában.
A Rhodes után Jensen hosszasan kutatott újabb munka után. Elment a Days of Our Lives meghallgatására is, ahol Samil rég elveszettnek hitt jó ikertestvérének a szerepét kapta meg. Nagy hatással volt mind a nézőkre, mind a kritikusokra ezért Emmy-re jelölték, majd később megnyerte a Soap Opera Digest's "Outstanding Male Newcomer" Award -ot (Szappanopera kategória: Kitűnő 'Újonc' Férfi Szereplő) 1997-ben.

Akárhogy is, Jensen még mindig kutatott más lehetőségek után. Jelentkezett az új Superman spin-off sorozat, a Smallville meghallgatására is, ahol Clark Kent szerepét szerette volna megkapni, de végül a készítők Tom Welling-t választották.

Néhny hónappal később otthagyta a Days of Our Lives-t, 2001-ben, hogy csatlakozzon a Fox sci-fi/dráma sorozatának, a   Dark Angel-nek a szereplőgárdájához.
Később Jensen-t felhívta valaki a Smallville-től, hogy lenne egy neki való szerep, amit direkt neki írtak bele a negyedik évadba. Jensen elfogadta és attól kezdve ő játszotta Jason Teague-t, Lana szerelmét. Elég sokáig maradt ott, de aztán leszerződött a WB egyik másik sikervárományos sorozatának a Supernatural-nak az egyik főszerepére, mely azóta a jogutód CW tv-n fut a 4. évaddal...